Q1:质粒DNA产量低?
A1:
1) 质粒拷贝数低。载体因拷贝数差异会造成质粒产量明显的波动。高拷贝数的载体常有2 ~3倍的产量波动(每毫升培养过夜的菌液,高拷贝数的质粒载体产量为3 - 16 μg)。长片段质粒和表达型载体常以中低拷贝数为主,每毫升菌液的产量约为0.5~2 μg;
l低拷贝质粒:pBR322, pACYC及其衍生载体,pSC101及其衍生载体,SuperCos, pWE15;
l高拷贝质粒:pTZ, pUC, pBS, pGM-T。
2) 菌种问题。菌种保存过程中存在质粒丢失现象,培养细菌前最好先划线活化,以稳定产量;
3) 细菌未充分裂解。细菌须在Buffer P1/RNase A 中充分重悬,成团的细菌因无法裂解会降低产量;
4) 试剂准备有误。Buffer P2若有沉淀析出需加热溶解,Buffer W1加入乙醇体积不准确;
5) 洗脱效率低。将Elution Buffer 预热至60~65℃,并进行二次洗脱。
Q2:质粒DNA中有基因组DNA污染?
A2:
1) 菌液培养时间太长。菌液培养时间需控制在12 ~16 h;
2) 裂解问题。加入Buffer P2时,必须轻柔颠倒混匀;处理多个样品时,加入Buffer P2时算起,总时间不要超过5 min。