Q1：逆转录后的 cDNA 产物进行 qPCR 检测，CT 值偏高？ 

A1： 

1) 模板 RNA 提取失败或存在降解。建议在逆转录反应前一定要电泳验证 RNA 的完整性，提取 RNA 后尽快进行逆转录及 qPCR 操作； 

2) 基因表达量较低。可适当提高模板 RNA 用量。

Q2：逆转录后进行 qPCR，熔解曲线非单一峰？ 

A2： 

1) RNA 模板中含有 gDNA。建议逆转录前进行去基因组反应或引物跨内含子设计； 

2) qPCR 引物特异性差。重新设计特异性较好的引物，可通过常规 PCR 检测引物特异性； 

3) 引物过量。引物过量可能形成引物二聚体，建议按说明书推荐用量添加； 

4) 体系可能存在污染。设置无模板阴性对照（NTC）检查体系是否存在污染，若存在污染，建议更换试 剂及耗材，使用核酸清洁剂清洁（目录号：ND709）操作台面及实验环境中的气溶胶污染。 

Q3：反转录产物 PCR 扩增无条带？ 

A3： 

1) PCR 体系不佳。可以先用内参引物进行扩增，可以成功扩增说明目的基因引物欠佳或反转录产物质量 欠佳；如果内参引物不能扩增成功，则有可能 PCR 体系或反转录产物质量欠佳； 

2) 模板质量不佳。RNA 发生降解或纯度偏低，建议电泳及测值检查模板质量； (3) 反转录引物使用不当。对于不含 poly(A)的 RNA，建议使用随机引物或特异性引物。 

Q4：总 RNA 反转录产物电泳观察不到？ 

A4： 

反转录产物是由模板反转录得到的，模板量本身比较低，反转录产物的量更低于模板量，且反转录产物大 小不均匀，因此电泳是观察不到的。

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